本法適用于無菌制劑、原料、輔料及醫(yī)療器械等物品的滅菌。無菌物品是指物品中不含任何活的微生物。然而，對于任何一批滅菌產(chǎn)品來說，無菌既無法保證也無法用試驗來證實。物理或化學手段滅菌試驗表明：微生物的殺滅遵循對數(shù)規(guī)則，因此，已滅菌物品的無菌標準一般以物品滅菌后微生物存活的概率-無菌保證水平SAL (Sterility Assurance Level)表示。zui終滅菌產(chǎn)品微生物存活的概率不得高于10-6。已滅菌產(chǎn)品達到的無菌保證水平可通過驗證確定。

 

滅菌產(chǎn)品的無菌保證并不能依賴于zui終產(chǎn)品的無菌檢驗，而是取決于生產(chǎn)過程中采用合格的滅菌工藝、嚴格的GMP管理和良好的全面質(zhì)量保證體系。滅菌工藝的確定應(yīng)綜合考慮被滅菌物品的性質(zhì)、滅菌方法的有效性和經(jīng)濟性、滅菌后物品的完整性和穩(wěn)定性等因素。滅菌程序的驗證是無菌保證的必要條件。滅菌程序經(jīng)驗證后，方可交付正式使用。

驗證內(nèi)容包括： 

⑴撰寫驗證方案及制定評估標準。

⑵確認滅菌設(shè)備技術(shù)資料齊全、安裝正確,并能處于正常運行（安裝確認）。 

⑶確認關(guān)鍵控制設(shè)備和儀表能在規(guī)定的參數(shù)范圍內(nèi)正常運行（運行確認）。 

⑷采用滅菌物品或模擬物品進行重復(fù)試驗，確認滅菌效果符合規(guī)定（性能確認）。 

⑸匯總并完善各種文件和記錄，撰寫驗證報告。

日常生產(chǎn)中，應(yīng)對滅菌程序的運行情況進行監(jiān)控，確認關(guān)鍵參數(shù)（如溫度、壓力、時間、濕度、滅菌氣體濃度及吸收的輻照吸收劑量等）均在驗證確定的范圍內(nèi)。

 

滅菌程序應(yīng)定期進行再驗證。當滅菌程序發(fā)生變更（包括滅菌物品裝載方式和數(shù)量的改變）時，應(yīng)進行再驗證。產(chǎn)品的無菌保證與滅菌前產(chǎn)品被污染的程度及污染菌的特性相關(guān)。因此，應(yīng)嚴格監(jiān)控被滅菌品滅菌前的微生物污染水平及污染菌的耐受性，并在生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)采取各種措施降低污染，確保微生物污染控制在規(guī)定的限度內(nèi)。滅菌后，應(yīng)防止已滅菌物品被再次污染。任何情況下，都應(yīng)要求容器及其密封系統(tǒng)確保產(chǎn)品在有效期內(nèi)符合無菌要求。 滅 菌 方 法 常用的滅菌方法有濕熱滅菌法、干熱滅菌法、氣體滅菌法、輻射滅菌法和過濾除菌法。可根據(jù)被滅菌物品的特性采用一種或多種方法組合滅菌。只要產(chǎn)品允許，應(yīng)盡可能選用zui終滅菌法（即產(chǎn)品分裝至包裝容器后再滅菌）滅菌。若產(chǎn)品不適合采用zui終滅菌法，可選用過濾除菌法或無菌生產(chǎn)工藝達到無菌保證要求，只要可能，應(yīng)對非zui終滅菌的產(chǎn)品作補充性滅菌處理（如流通蒸汽滅菌）。

 

 

一、濕熱滅菌法

 

本法系指將物品置于滅菌柜內(nèi)利用高壓飽和蒸汽、過熱水噴淋等手段使微生物菌體中的蛋白質(zhì)、核酸發(fā)生變性而殺滅微生物的方法 。該法滅菌能力強，為熱力滅菌中zui有效、應(yīng)用zui廣泛的滅菌方法。藥品、容器、培養(yǎng)基、無菌衣、膠塞以及其它遇高溫和潮濕不發(fā)生變化或損壞的物品，均可用本法滅菌。流通蒸汽不能*殺滅細菌孢子，一般可作為不耐熱無菌產(chǎn)品的輔助滅菌手段。

 

濕熱滅菌條件通常采用121℃×20min或116℃×40min的程序，也可采用其它溫度和時間參數(shù)?？傊?，必須保證物品滅菌后的SAL≤10-6。對熱穩(wěn)定的物品，可采用過度殺滅法，其SAL應(yīng)≤10-12。熱敏感產(chǎn)品的標準滅菌時間F0可低于8min，但應(yīng)在生產(chǎn)全過程中，對產(chǎn)品中污染的微生物嚴加監(jiān)控，并采取各種措施防止耐熱菌污染及降低微生物污染水平，確保被滅菌產(chǎn)品達到無菌保證要求。

 

采用濕熱滅菌時，被滅菌物品應(yīng)有適當?shù)陌b和裝載方式，保證滅菌的有效性和均一性。

 

濕熱滅菌工藝驗證時，應(yīng)進行熱分布試驗、熱穿透試驗和生物指示劑驗證試驗。以確定滅菌柜空載及不同裝載時腔室中的熱分布狀況及可能存在的冷點；在空載條件下，確認121℃時腔室各點的溫度差值應(yīng)≤±1℃；使用插入實際物品或模擬物品內(nèi)的溫度探頭，確認滅菌柜在不同裝載時，zui冷點物品的標準滅菌時間（F0）達到設(shè)定的標準；用生物指示劑進一步確認在不同裝載時冷點處的滅菌物品達到無菌保證水平。本法常用的生物指示劑為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus)。

 

 

二、干熱滅菌法

 

本法系指物品于干熱滅菌柜、隧道滅菌器等設(shè)備中、利用干熱空氣達到殺滅微生物或消除熱原物質(zhì)的方法。適用于耐高溫但不宜用濕熱滅菌法滅菌的物品的滅菌，如玻璃器具、金屬制容器、纖維制品、固體試藥、液狀石蠟等均可采用本法滅菌。

 

干熱滅菌條件一般為160～170℃×120min以上、170～180℃×60min以上或250℃×45min以上，也可采用其它溫度和時間參數(shù)。總之，應(yīng)保證滅菌后的產(chǎn)品其SAL≤10-6。干熱過度殺滅后產(chǎn)品的SAL應(yīng)≤10-12，此時物品一般無需進行滅菌前污染微生物的測定。250℃ 45min的干熱滅菌也可除去無菌產(chǎn)品包裝容器及有關(guān)生產(chǎn)灌裝用具中的熱原物質(zhì)。

 

采用干熱滅菌時，被滅菌物品應(yīng)有適當?shù)陌b和裝載方式，保證滅菌的有效性和均一性。

 

干熱滅菌法驗證與濕熱滅菌法相同，應(yīng)進行熱分布試驗、熱穿透試驗、生物指示劑驗證試驗或細菌內(nèi)毒素滅活驗證試驗。以確認滅菌柜中的溫度分布符合設(shè)定的標準、確定zui冷點位置、確認zui冷點標準滅菌時間（FH）能達到設(shè)定標準并達到SAL要求。常用的生物指示劑為枯草芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus subtilis)。細菌內(nèi)毒素滅活驗證試驗是證明除熱原過程有效性的試驗。一般將不小于1000單位的細菌內(nèi)毒素加入待去熱原的物品中，證明該去熱原工藝能使內(nèi)毒素至少下降3個對數(shù)單位。細菌內(nèi)毒素滅活驗證試驗所用的細菌內(nèi)毒素一般為大腸桿菌內(nèi)毒素（Escherichia coli endoxin）。驗證時，一般采用zui大裝載方式。

 

 

三、輻射滅菌法

 

本法系指將滅菌產(chǎn)品置于適宜放射源輻射的γ射線或適宜的電子加速器發(fā)生的電子束中進行電離輻射而達到殺滅微生物的方法。本法zui常用的為60Co-γ射線輻射滅菌。醫(yī)療器械、容器、生產(chǎn)輔助用品、不受輻射破壞的原料藥及成品等均可用本法滅菌。

 

采用輻射滅菌法滅菌的無菌產(chǎn)品其SAL應(yīng)≤10-6。γ射線輻射滅菌所控的參數(shù)主要是輻射劑量（指滅菌物品的吸收劑量）。該劑量的制定應(yīng)考慮滅菌物品的適應(yīng)性及可能污染的微生物zui大數(shù)量及zui強抗輻射力，所使用的劑量事先應(yīng)驗證其有效性及安全性。常用的輻射滅菌吸收劑量為25kGy。對zui終產(chǎn)品、原料藥、某些醫(yī)療器材應(yīng)盡可能采用低輻射劑量滅菌。滅菌前，應(yīng)對被滅菌物品微生物污染的數(shù)量和抗輻射強度進行測定，以評價滅菌過程賦予該滅菌物品的無菌保證水平。

 

滅菌時，應(yīng)采用適當?shù)幕瘜W或物理方法對滅菌物品吸收的輻射劑量進行監(jiān)控，以充分證實滅菌物品吸收的劑量是在規(guī)定的限度內(nèi)。如采用與滅菌物品一起被輻射的放射性劑量計，劑量計要置于規(guī)定的部位。在初安裝時劑量計應(yīng)用標準源進行校正，并定期進行再校正。

 

60Co-γ射線輻射滅菌法驗證時，除進行生物指示劑驗證試驗外，還應(yīng)確認空載和裝載時滅菌腔內(nèi)的輻射劑量的分布圖、滅菌物品的吸收劑量及zui大和zui小吸收劑量的分布、滅菌物品的均一性、滅菌腔內(nèi)物品的裝載方式等。常用的生物指示劑為短小芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus pumilus)。

 

 

四、氣體滅菌法

 

本法系指用化學消毒劑形成的氣體殺滅微生物的方法。在充有滅菌氣體的高壓腔室內(nèi)進行。常用的化學消毒劑有環(huán)氧乙烷、氣態(tài)過氧化氫、甲醛、臭氧（O3）等，本法適用于在氣體中穩(wěn)定的物品滅菌。采用氣體滅菌法時，應(yīng)注意滅菌氣體的可燃可爆性、致畸性和殘留毒性。

 

本法中zui常用的氣體是環(huán)氧乙烷，一般與80％～90％的惰性氣體混合使用。該法可用于醫(yī)療器械，塑料制品等不能采用高溫滅菌的物品滅菌。含氯的物品及能吸附環(huán)氧乙烷的物品則不宜使用。另外，使用氣態(tài)過氧化氫和臭氧（O3）滅菌，因其無危害性殘留物，不會對操作人員和環(huán)境造成危害，適合于空間和物品表面的滅菌。

 

采用環(huán)氧乙烷滅菌時，滅菌柜內(nèi)的溫度、濕度、滅菌氣體濃度、滅菌時間是影響滅菌效果的重要因數(shù)。可采用下列滅菌條件：

 

溫度 （ 54 ±10）℃

 

相對濕度 （60±10）%

 

滅菌壓力 8×105Pa

 

滅菌時間 90min

 

滅菌條件應(yīng)予驗證。滅菌時，先將滅菌腔室先抽成真空，然后通入蒸汽使腔室內(nèi)達到設(shè)定的

 

溫濕度平衡的額定值，再通入經(jīng)過濾和預(yù)熱的環(huán)氧乙烷氣體。滅菌過程中，應(yīng)嚴密監(jiān)控腔室的溫度、濕度、壓力、環(huán)氧乙烷濃度及滅菌時間。必要時使用生物指示劑監(jiān)控滅菌效果。本法滅菌程序的控制具有一定難度，整個滅菌過程應(yīng)在技術(shù)熟練人員的監(jiān)督下進行。滅菌后，應(yīng)采取新鮮空氣置換，使殘留環(huán)氧乙烷和其他易揮發(fā)性殘渣消散。并對環(huán)氧乙烷殘留物和反應(yīng)產(chǎn)物進行監(jiān)控，以證明其不超過規(guī)定濃度，避免產(chǎn)生毒性。

 

環(huán)氧乙烷滅菌法驗證時，應(yīng)進行如下試驗：泄漏試驗，以確認滅菌腔室的密閉性；生物指示劑的驗證試驗，指示劑一般采用枯草芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus subtilis)；滅菌后換氣次數(shù)的驗證試驗，確認環(huán)氧乙烷及相應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物含量在限定的范圍內(nèi)。驗證設(shè)計時，還應(yīng)考慮物品包裝材料和滅菌腔室中物品的排列方式對滅菌氣體的擴散和滲透的影響。

 

 

五、過濾除菌法

 

本法系利用細菌不能通過致密具孔濾材的原理以除去氣體或液體中微生物的方法。常用于熱不穩(wěn)定的藥品溶液或原料的除菌。

 

除菌過濾器采用孔徑分布均勻的微孔濾膜作過濾材料，微孔濾膜分親水性和疏水性兩種。濾膜材質(zhì)依過濾物品的性質(zhì)及過濾目的而定。藥品生產(chǎn)中采用的除菌濾膜孔徑一般不超過0.22μm。過濾器不得對被濾過成分有吸附作用，也不能釋放物質(zhì)，不得有纖維脫落，禁用含石棉的過濾器。濾器和濾膜在使用前應(yīng)進行潔凈處理，并用高壓蒸汽進行滅菌或作在線滅菌。更換品種和批次應(yīng)先清洗濾器，再更換濾膜。

 

過濾過程中無菌保證與過濾液體的初始生物負荷及過濾器的對數(shù)下降值LRV(Log Reduction Value)有關(guān)。LRV系指規(guī)定條件下，被過濾液體過濾前的微生物數(shù)量與過濾后的微生物數(shù)量比的常用對數(shù)值。

 

即： LRV=lgN0- LgN 式中N0為產(chǎn)品除菌前的微生物數(shù)量。 N 為產(chǎn)品除菌后的微生物數(shù)量。

 

LRV用于表示過濾器的過濾除菌效率，對孔徑為0.22μm的過濾器而言，要求每1cm2有效過濾面積的LRV應(yīng)不小于7。因此過濾除菌時，被過濾產(chǎn)品總的污染量應(yīng)控制在規(guī)定的限度內(nèi)。為保證過濾除菌效果，可使用兩個過濾器串連過濾，或在灌裝前用過濾器進行再次過濾。

 

在過濾除菌中，一般無法對全過程中過濾器的關(guān)鍵參數(shù)（濾膜孔徑的大小及分布，濾膜的完整性及LRV）進行監(jiān)控。因此，在每一次過濾除菌前后均應(yīng)作濾器的完整性試驗，即氣泡點試驗或壓力維持試驗或氣體擴散流量試驗。確認濾膜在除菌過濾過程中的有效性和完整性。除菌過濾器的使用時間不應(yīng)超過一個工作日，否則應(yīng)進行驗證。

 

過濾系統(tǒng)的驗證包括過濾系統(tǒng)對過濾液體的適應(yīng)性、過濾材料對溶液的污染程度、過濾器的規(guī)格、過濾器的滅菌方法、過濾系統(tǒng)的完整性試驗、生物指示劑試驗、過濾液體的微生物含量控制及過濾時間、過濾器的使用壽命等。上述試驗大部分可由濾器的生產(chǎn)廠商來進行。微生物挑戰(zhàn)性試驗常用的生物指示劑為缺陷假單胞菌(Pseudomonas diminuta)。

 

通過過濾除菌法達到無菌的產(chǎn)品應(yīng)嚴密監(jiān)控其生產(chǎn)環(huán)境的潔凈度，建議在無菌環(huán)境下進行過濾操作。相關(guān)的設(shè)備、包裝容器、塞子及其它物品應(yīng)采用適當?shù)姆椒ㄟM行滅菌，并防止再污染。

 

六、無菌生產(chǎn)工藝

 

無菌生產(chǎn)工藝系指必須在無菌控制條件下生產(chǎn)無菌制劑的方法，無菌分裝及無菌凍干是zui常見的無菌生產(chǎn)工藝。后者在工藝過程中須采用過濾除菌法。

 

無菌生產(chǎn)工藝應(yīng)嚴密監(jiān)控其生產(chǎn)環(huán)境的潔凈度，并應(yīng)在無菌控制的環(huán)境下進行過濾操作。相關(guān)的設(shè)備、包裝容器、塞子及其它物品應(yīng)采用適當?shù)姆椒ㄟM行滅菌，并防止被再次污染。

 

無菌生產(chǎn)工藝過程的無菌保證應(yīng)通過培養(yǎng)基無菌灌裝摸擬試驗驗證，試驗結(jié)果的陽性率不得超過0.1%(置信度取95%)。在生產(chǎn)過程中，應(yīng)嚴密監(jiān)控生產(chǎn)環(huán)境的無菌空氣質(zhì)量、操作人員的素質(zhì)、各物品的無菌性。

 

無菌生產(chǎn)工藝應(yīng)定期進行驗證，包括對環(huán)境空氣過濾系統(tǒng)有效性驗證及培養(yǎng)基模擬灌裝試驗。

 

生物指示劑

 

生物指示劑系一類特殊的活微生物制品?？捎糜诖_認滅菌設(shè)備的性能、滅菌程序的驗證、生產(chǎn)過程滅菌效果的監(jiān)控等。用于滅菌驗證中的生物指示劑一般是細菌的孢子。

 

手提式滅菌器的性能特點：

全不銹鋼材料制成，經(jīng)久耐用；

座式結(jié)構(gòu)，放置穩(wěn)定；

設(shè)有定時開關(guān)，保溫時間控制，操作方便；

膠木星形螺桿，操作時不燙手；

設(shè)有放水，方便排放濃縮水；

壓力表同時顯示器內(nèi)壓力和溫度，清晰明了；

安全閥自動控制壓力和滅菌溫度，安全可靠；

放汽閥可以排盡桶內(nèi)冷空氣和冷凝水；

徑向自脹覆蓋結(jié)構(gòu)，操作簡便省力；

自脹式硅橡膠密封圈，密封效果好，使用壽命長。